پروتکل تکثیر نهال بلوبری به روش کشت بافت
بلوبری (Vaccinieae, Vaccinioideae, Ericaceae) درختچه ای دائمی برگریز یا همیشه سبز است. میوه بلوبری (Blueberry) سرشار از آنتوسیانین، اسیدهای چرب غیراشباع، کلسیم، پتاسیم، روی، آهن و سایر عناصر است.
بلوبری به عنوان یکی از پنج غذای بهداشتی برتر توسط سازمان بین المللی غذا و کشاورزی فهرست شده است . همچنین میوه این گیاه به دلیل وجود آنتی اکسیدان ها و خواص بالای آن به عنوان پادشاه میوه ها نیز شناخته می شود. همین امر سبب شده تا میوه های خانواده بری (Berry) در آینده به یکی از امیدوارکننده ترین گونه های درخت میوه در جهان برای تغذیه و سلامت بشر تبدیل شود.
در سال های اخیر با افزایش درک از تاثیر میوه بلوبری در سلامت انسان، تقاضای مصرف میوه این گیاه در بازارهای جهانی به طور پیوسته افزایش یافته است. این افزایش شدید تقاضا باعث گسترش سریع صنعت تولید بلوبری به ویژه در مرحله نهال و کاشت شده است. بنابراین نیاز مبرمی به تولید سریع نهال بلوبری وجود دارد.
با بهبود مستمر تقاضای بازار برای بلوبری، مقیاس و سطح کاشت همچنان در حال گسترش است و عملکرد به میزان قابل توجهی افزایش یافته است. سرعت و ضریب تکثیر این گیاه از طریق قلمه زدن کند و کم است. تکثیر نهال به روش قلمه برای عرضه به موقع و با کیفیت به بازار بسیار مشکل است.
کشت بافت گیاهی فناوری است که در آن بافت، اندام و سلول جدا شده از گیاه به صورت آسپتیک در محیطی حاوی مواد مغذی و هورمون‌های گیاهی کشت می‌شوند و کل گیاه باززایی می‌شود.
کشت بافت گیاهی دارای مزایای قابل توجهی در پرورش نهال ها از جمله سرعت تکثیر بالا، سلامت نهال، کیفیت و کارایی بالا و عدم محدودیت زمانی می باشد. تولید نهال بلوبری به روش کشت بافت به سرعت در حال گسترش و اقبال در بازارهای جهانی است.
مواد و روش ها
انتخاب و استریل سطحی ریزنمونه
ریزنمونه های انتخابی بهتر است از جوانه های برگ های جوان (بدون دمبرگ) و شاخساره (بدون برگ) بلوبری دو ساله کاملا سالم که در اسکرین هاوس (Screen House) نگهداری شده اند ، به دست آورد. برای استریل از روش های مختلفی استفاده می شود که در ادامه به دو روش پرکاربردتر اشاره می کنیم:
روش اول استریل ریزنمونه بلوبری
ریزنمونه های انتخابی را به مدت ۶ دقیقه در زیر آب جاری شسته و سپس پنج بار با ddH2O استریل شوند. در مرحله بعد با الکل ۷۵ درصد به مدت ۲۰ ثانیه و سپس با ۲% (v/v) NaClO به ترتیب برای ۵ دقیقه تا ۸ دقیقه استریل شوند. در نهایت ریزنمونه های استریل شده با آب مقطر شستشو داده شوند.
روش دوم استریل ریزنمونه بلوبری
جوانه های جوان را به مدت ۱ ساعت با آب جاری شستشو دهید.
سپس ریزنمونه ها را به مدت ۲ دقیقه در اتانول ۷۰ درصد استریل کنید.
در مرحله بعد، ریزنمونه ها را به مدت ۶ دقیقه با محلول ۰.۱% کلرید جیوه همراه با ۳ قطره توئین استریل شود.
در آخرین مرحله، ریزنمونه ها را هر کدام سه بار در آب مقطر استریل با دقت شستشو دهید.
محیط کشت و ترکیبات هورمونی
محیط کشت WPM و محیط کشت AN (Anderson) بعنوان محیط کشت پایه مورد استفاده قرار می گیرند. ترکیب ۲۵ تا ۳۰ گرم در لیتر ساکارز، ۷.۵ تا ۸ گرم در لیتر آگار و Ph 4.5 تا ۵ را بعنوان پایه در نظر می گیریم. برای مرحله باززایی ساقه از mg/L 2 (میلی گرم در لیتر) هورمون Zeatin (زآتین) استفاده می شود.
برای محیط کشت WPM توصیه می شود از ۲۵ گرم در لیتر ساکارز و ۶.۵ گرم در لیتر آگار استفاده شود. میزان Ph توصیه شده برای این محیط کشت پایه نیز ۵.۲ می باشد.
از آنجایی که تنظیم کننده های رشد گیاه (هورمون های گیاهی) به حرارت حساس هستند، باید بعد از اتوکلاو و زیر لامینارایرفلو با استفاده از فیلتر به محیط کشت اضافه شوند.
ویتامین های محیط کشت
آدنین همی سولفات (Adenin Hemisulphate) به مقدار mg/L 80 ، میواینوسیتول (Myo-Inositol) به مقدار mg/L 100 و از تیامین (Thiamin-HCl) به مقدار mg/L 0.4 ، ویتامین های مورد نیاز محیط کشت AN بلوبری در مرحله ساقه زایی هستند.
عناصر ماکرو و میکرو محیط کشت (نمک ها)
نیترات آمونیوم (NH۴NO۳) mg/l-۱ ۴۰۰، مونو سدیم فسفات (NaH2PO4) mg/l-۱ ۳۳۰.۶، سولفات منیزیم (MgSO4) mg/l-۱ ۱۸۰.۵۴ ، نیترات پتاسیم (KNO۳) mg/l-۱ ۴۸۰، کلسیم کلراید (CaCl۲) mg/l-۱ ۳۳۲، فریک سدیم ( FeNaEDTA) mg/l-۱ ۷۳.۴، بوریک اسید (H3BO3) mg/l-۱ ۶.۲ ، بخشی از ترکیب پیشنهادی برای نمک ها و عناصر مورد نیاز محیط کشت بلوبری است.
مرحله پرآوری ، تکثیر ریز شاخه ها
Proliferation & Multiplication
ریزشاخه ها یا Microshoots در کشت بافت بلوبری معمولا بین غلظت ۰.۵ تا ۲ میلی گرم در لیتر mg/l-۱ هورمون Zeatin تحریک می شوند. در این مرحله نیازی به تغییر غلظت ویتامین ها، نمک ها و سایر ترکیبات محیط کشت پایه نمی باشد. همچنین استفاده از ذغال فعال در این مرحله توصیه نمی شود.
پس از به دست آوردن شاخه های با ارتفاع تعیین شده، آنها را پس از هر ۵-۶ هفته تحت واکشت قرار دهید. ریزنمونه ها را پس از کشت، در دمای ۱ ± ۲۵-۲۳ درجه سانتیگراد تا دوره نوری ۱۶ ساعت با شدت نور ۵۰-۷۰ میکرومول بر m-2.s-1 که توسط لامپ های فلورسنت سفید بسته به ژنوتیپ های مختلف ارائه می شود، نگهداری کنید.
محیط رشد بهینه برای جوانه بلوبری در WPM حاوی ۰.۱ میلی گرم در لیتر CPPU، ۰.۴ میلی گرم در لیتر ۲-ip بود که با آن رشد و سلامت جوانه ها بطور معنا داری بهتر گزارش شده است.
ریشه زایی (Rooting)
استفاده از ذغال فعال (Charcoal Activated) به مقدار mg/l-۱ ۰.۸ و همچنین مصرف هورمون ایندول بوتریک اسید (IBA) نیز به مقدار mg/l-۱ ۰.۸ برای ریشه زایی در این مرحله ضروری است. محیط کشت پایه می تواند با همان ترکیبات اولیه باقی مانده و نیازی به تغییر غلظت ساکاروز و سایر عناصر نمی باشد. همچنین توصیه می شود همواره میزان اسیدیته Ph محیط کشت بلوبری روی ۴.۵ تا ۵ تثبیت شود.
محیط ریشه زایی بهینه در محیط ۲/۱ موراشیگ و اسکوگ (۱/۲MS) حاوی ۰.۲ میلی گرم در لیتر نفتیل استیک اسید (NAA) بود که سرعت ریشه زایی را بطور قابل توجهی کوتاهتر کرده و همچنین سبب افزایش سرعت رشد ریشه فرعی شده است. (راهنمای ساخت و تهیه محیط کشت MS)
کالوس زایی بلوبری
طبق گزارش منتشر شده در ۲۳ ژانویه ۲۰۲۳ در پایگاه MDPI ، محیط بهینه برای القای کالوس در محیط کشت WPM (محیط گیاهی چوبی) حاوی ۰.۲ میلی گرم در لیتر فورکلرفنورون (CPPU)، ۰.۲ میلی گرم در لیتر ۲-ایزوپنتنی لادنین (۲-ip) بوده که با نرخ القای کالوس ۹۷٪ و نرخ تمایز کالوس ۷۱٪ بهترین نتایج حاصل شده است. در این روش از برگ های بلوبری به عنوان ریزنمونه استفاده شد. کشت ثانویه بهینه محیط کشت کالوس برگ WPM حاوی ۰.۳ میلی گرم در لیتر CPPU با ضریب افزایش ۲۴ درصد گزارش شده است.
توجه : حتما به این نکته دقت شود که آنچه در این مقاله ذکر شد صرفا راهنمایی برای به دست آوردن دید کلی از کشت بافت و ریزازدیادی نهال بلوبری است و ایم پروتکل برای تکثیر تجاری بلوبری کافی نمی باشد. لازم است پروتکل تکثیر تجاری را در منابع معتبر خریداری کرده و یا در آزمایشگاه های بیوتکنولوژی گیاهی نسبت به ستاپ Set-up آن اقدام کنید.
